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    實(shí)驗(yàn)筆記丨免疫組織化學(xué)染色（IHC）步驟詳解
    來(lái)源： 時(shí)間：2022-11-02 15:34:07 瀏覽：4716次

    免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)）。


    包埋組織

    在４％多聚甲醛溶液中固定組織48小時(shí)后，放入一次性組織包埋盒中脫水，浸蠟后包埋。


    修片


    修剪石蠟切片，直至將石蠟切片修到大部分組織在切面上。

    組化


    3.1 蠟塊制備

    將組織蠟塊提前泡到冰水混合物中使其變軟，將組織蠟塊放在切片機(jī)上切出５微米的切片，60°Ｃ烘片１小時(shí)。


    3.2 脫蠟

    １）將切片放到60°Ｃ烘箱中烘片４ｈ以上。

    ２）在二甲苯I里置入片子，持續(xù)0.5 h，再置于二甲苯II，依然持續(xù)0.5 h。


    3.3 水化

    １）通過(guò)酒精，浸泡切片，酒精濃度不一，分為７０％、８０％、９０％、９５％、１００％，各濃度浸泡時(shí)間也有所差異，前３個(gè)濃度都是各自浸泡２分鐘，后面兩個(gè)濃度分別浸泡5分鐘、10分鐘。

    ２）最后將片子放到雙蒸水中浸泡２min。


    3.4 組化

    １）封閉處理：選擇內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，處理時(shí)間為20 min。

    ２）用雙蒸水浸泡三次，單次時(shí)間5 min。

    ３）抗原修復(fù)：準(zhǔn)備pH＝6.0的10 nM檸檬酸抗原修復(fù)液400-600 ml，把片子放到里面，用保鮮膜封住燒杯口防止沸騰溢出。之后放到微波爐中用高火加熱10 min。

    ４）加熱后用雙蒸水補(bǔ)齊液面，在微波爐中加熱40 min（中低火至解凍之間），每隔10 min用雙蒸水補(bǔ)齊液面。

    ５）修復(fù)結(jié)束后，放到室溫下，使其自然冷卻。

    ６）DDW清洗180＂之后，通過(guò)PBS清洗，３分鐘／次，進(jìn)行三次。

    ７）通過(guò)一抗封閉，保持４°Ｃ，第二天進(jìn)行溫度回升，為37°Ｃ，然后通過(guò)PBS清洗，持續(xù)５分鐘。

    ８）在其中添加反應(yīng)增強(qiáng)液，然后孵育，室溫條件，持續(xù)20 min，再通過(guò)PBS清洗，３分鐘／次，進(jìn)行三次。

    ９）加入增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗小鼠／兔IgG聚合物，然后孵育，室溫條件，持續(xù)20 min，再通過(guò)PBS清洗，3分鐘／次，進(jìn)行三次。

    1０）滴加DAB顯色液（現(xiàn)用現(xiàn)配、比例1:19），室溫孵育2-10 min（根據(jù)不同的抗體自行選擇染色時(shí)間）。用自來(lái)水輕輕沖洗掉。

    １１）復(fù)染：加蘇木精染色50 s。用DDW，3 min，PBS，５min X３次。

    １２）脫水：將片子依次浸泡到不同濃度的酒精梯度中：７０％，ｌｍｉｎ—８０％，ｌｍｉｎ—９０％，1 ｍｉｎ—９５％ Ｉ，５ｍｉｎ—９５％ II ，５ｍｉｎ—１００％Ｉ，５ｍｉｎ—１００％ II，５ｍｉｎ。

    １３）透明：利用二甲苯Ｉ、二甲苯 II 進(jìn)行處理，每次處理持續(xù)20 min。

    １４）中性樹(shù)脂封片，中性樹(shù)脂，加蓋玻片(組織部位切勿殘留小氣泡)，自然晾干。

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    文字是人類(lèi)用符號(hào)記錄表達(dá)信息以傳之久遠(yuǎn)的方式和工具?，F(xiàn)代文字大多是記錄語(yǔ)言的工具。人類(lèi)往往先有口頭的語(yǔ)言后產(chǎn)生書(shū)面文字，很多小語(yǔ)種，有語(yǔ)言但沒(méi)有文字。文字的不同體現(xiàn)了國(guó)家和民族的書(shū)面表達(dá)的方式和思維不同。文字使人類(lèi)進(jìn)入有歷史記錄的文明社會(huì)。
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